Трансгенные животные были получены экспериментальным путем. Они содержат во всех своих. Введение Трансгенные животные это экспериментально полученные животные, содержащие во всех клетках своего органызма дополнительную.

1. Трансгенные Животные Презентация
2. Трансгенные Животные И Растения Презентация

Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. В результа­те неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участ­ком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужно­го размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (US) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципнента. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы СS1 и СS2, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые нахо­дятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одно­го размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансген (ТG), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встро­ился в определенный сайт хромосомы. «Нокаут» гена с помощью направленной гомологичной рекомбинации.

Вектор несет селективный маркерный ген (smg) и фланкирующие его последовательности, гомологичные соответствующим участкам гена-мишени. Последний содержит пять экзонов (1 – 5).

В результате гомологичной рекомбинации (штриховые линии) ген-мишень прерывается («нокаутируется»). Клонирование с помощью переноса ядра Плюрипотентность можно выявить, если пере­нести ядро тестируемой клетки в яйцеклетку с удаленным ядром и затем исследовать способ­ность последней к развитию и образованию жизнеспособного потомства. В нескольких ла­бораториях с переменным успехом исследовали плюрипотентность линий эмбриональных кле­ток, клеток плода и взрослой особи. Было пока­зано, что ядра эмбриональных клеток способны - хотя и с низкой эффективностью — обеспечивать развитие. Например, с помощью переноса ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота, культивированных непродолжительное время, были получены жизнеспособные особи.

Всем известная овца по имени Долли была кло­нирована с помощью переноса ядра клетки молочной железы (вымени) взрослого животного (рис. Так впервые была доказана плюрипотентность ядра дифференцированной взрос­лой клетки.

Впрочем, нельзя исключить, что на самом деле донорское ядро было взято из не­дифференцированной клетки, присутствовав­шей в эпителии молочной железы организма-донора. Клонирование Долли из ядра дифференци­рованной клетки и трех других овец из ядер эмб­риональных клеток удалось осуществить благо­даря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G 0), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. Дело в том, что в течение первых трех делений зиготы овцы, за­нимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время вве­денная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответству­ющие гены эмбрионального развития связыва­ются с инициаторными эмбриональными бел­ковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки. Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание трансгенных живот­ных с помощью метода переноса ядер стало ре­альным, — это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. Если это удаст­ся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных организмов станет почти рутинной процедурой.

Однако вследствие видо­вых различий во времени процесса деления клетки на ранних стадиях эмбриогенеза и ини­циации транскрипции в этот период пока не яс­но, удастся ли осуществить перенос ядра в слу­чае каких-либо других домашних животных, кроме овец, если донорское ядро будет находит­ся на той же стадии, что и яйцеклетка. Клонирование овцы методом переноса ядра. Ядро яйцеклетки удаляют с помощью микропипетки. Культивируют эпителиальные клетки молочной железы взрослой особи и индуцируют их переход в фазу G.

Осуществляют слияние клетки в G o-фазе и яйцеклеток, лишенных ядра, и выращивают восстановленные яйцеклетки в культуре или в яйцеводе с наложенной лигатурой до ранних стадий эмбриогенеза, а затем импланти­руют их в матку «суррогатной» матери, где и происходит дальнейшее развитие. В эксперименте, описанном Уилмутом и др., было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе G о; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода. Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом Хромосомы высших организмов содержат в своем составе протяженные молекулы ДНК. Например, длина ДНК одной из типичных хромосом человека составляет 100–200 миллионов пар оснований (м.п.о.).

Исследование генов в хромосомах высших растений, животных и человека потребовало создания векторов для клонирования фрагментов ДНК длиной в несколько сотен тысяч пар оснований. Этим задачам отвечает недавно созданная система для клонирования сверхдлинных молекул ДНК на основе искусственно полученной мини-хромосомы дрожжей YAC (yeast artificial chromosome).

YAC-вектор представляет собой кольцевую молекулу ДНК, содержащую ряд генетических элементов, которые позволяют ей существовать во внехромосомном состоянии в клетках дрожжей (рис. 9). Вектор заключает в себе две теломерные последовательности нуклеотидов TEL, необходимые для репликации концов мини-хромосомы, и область начала репликации ARS1, соединенную с последовательностью центромеры. Все эти функциональные элементы требуются для репликации YAC-вектора и его правильной передачи в дочерние ядра во время митоза. Кроме того, вектор содержит два селектируемых маркера TRP, восстанавливающих способность к росту ауксотрофных по триптофану клеток дрожжей в отсутствие экзогенного триптофана, а также маркер URA3, компенсирующий генетический дефект клеток дрожжей, который нарушает биосинтез урацила. В векторе имеется также ген супрессорной тРНК sup4, являющийся селектируемым маркером для поддержания вектора в мутантных бактериальных клетках, содержащих амбер-мутации в жизненно важных генах.

Помимо этого, он обладает последовательностями нуклеотидов, необходимыми для его репликации в бактериальных клетках. При подготовке к клонированию YAC-вектор, выделенный в виде плазмиды, расщепляют рестриктазой BamHI и отделяют от образовавшегося короткого фрагмента ДНК, который не требуется для репликации YAC-вектора в дрожжах (этап 1). После этого проводят второе расщепление вектора рестриктазой EcoRI, сопровождающееся образованием двух его 'плеч', каждое из которых на одном из концов содержит теломерные последовательности хромосомы дрожжей (этап 2). На заключительном этапе (3) полученные 'плечи' лигируют с крупными EcoRI-фрагментами клонируемой ДНК, которые получают путем частичного расщепления высокомолекулярной хромосомной ДНК, предназначенной для клонирования.

Полученными таким образом рекомбинантными ДНК трансформируют протопласты клеток дрожжей, и образовавшиеся трансформанты отбирают на селективной твердой питательной среде. В таком векторе удавалось осуществлять клонирование фрагментов ДНК длиной до 700 т.п.о.

При всех своих достоинствах системы клонирования, основанные на векторах семейства YAC, обладают рядом существенных недостатков. В рекомбинантных ДНК, поддерживаемых в таких системах, часто возникают внутренние делеции. Кроме того, при введении рекомбинантных ДНК в клетки дрожжей иногда имеет место проникновение в одну клетку нескольких молекул вектора со вставками. В итоге отдельные клоны дрожжевых клеток могут содержать несколько несцепленных друг с другом молекул рекомбинантных ДНК, а рекомбинация между ними вообще может приводить к образованию химерных молекул. Все это очень затрудняет физическое картирование генов в хромосомах исследуемых объектов. Рис. 9. Схема клонирования сверхдлинных молекул ДНК с использованием вектора YAC 1 – линеаризация ДНК вектора рестриктазой BamHI; 2 – расщепление линеаризованной ДНК вектора рестриктазой EcoRI с образованием 'плечей'; 3 – введение в вектор клонируемого EcoRI-фрагмента ДНК Трансгенных мышей получали микроинъек­цией в пронуклеус оплодотворенной яйцеклет­ки или трансфекцией ЕS-клеток с помощью YАС, несущих несколько родственных генов или один большой ген. Трансгенные мыши, не­сущие кластер из пяти функциональных генов β-глобина человека суммарной длиной пример­но 250 т.

Трансгенные Животные Презентация

Н., экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время — точно так же, как это происходит у человека. Такое соответствие обеспечивалось фланкирующими их последовательностями, которые содержат промотор и другие важные регуляторные элементы. Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, — это примеча­тельный пример трансгеноза с помощью YАС. Моноклональные антите­ла можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить челове­ческие моноклональные антитела практически невозможно. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Чтобы «очеловечить» существующие моноклональные антитела грызунов, были разработаны сложные стратегии с использованием рекомбинантных ДНК.

В результате этих трудоемких процедур удалось получить Fv- и Fab-фрагменты, зачастую обладающие каким-то сродством к специфическому антигену. Возможно, техноло­гического прорыва удастся достичь, если ис­пользовать для получения полноразмерных че­ловеческих антител более доступный метод с использованием гибридом. Синтез природных антител — это настоящее чудо. Антитело — очень сложная тетрамерная конструкция, состоящая из двух пар разных це­пей. Одна из них называется тяжелой (Н), а дру­гая - легкой (λ или κ). Эти термины отражают различия в молекулярных массах субъединиц антитела. Генетические особенности каждой тя­желой цепи определяются комбинацией вариа­бельного (V H), дивергентного (D H), шарнирного (J H) и константного (С H) участков (доменов) со­матической ДНК в В-клетке.

Известны два типа легких цепей, λ и κ, которые образуются в ре­зультате перестройки их собственных вариа­бельных (Vλ, Vκ, шарнирных (Jλ, Jκ) и кон­стантных (Сλ, Сκ) доменов. Данная В-клетка синтезирует один вид антител, с уникальной комбинацией участков, составляющих Н-цепь, и либо перестроенной λ-, либо κ-цепью. Набор генетических элементов, обеспечива­ющих образование множества разных Н-цепей антител человека, включает около 95 V H-доме­нов, 30 D H-доменов, 6 J H-доменов и 5 основных константных (Сα, Сγ, Сδ, Сε, Сμ) доменов. Локус κ-генов содержит примерно 76 Vκ-доменов, 5 Jκ-доменов и один константный (Сκ) участок.

Размер Н-локусов и κ-генов — от 1 до1,5 т. Для создания трансгенных мышей, способных синтезировать множество различных человеческих антител, необходимо инактивировать мышиные гены Н- и L-цепей, а затем встроить в хромосомную ДНК мыши YАС, со­держащую гены Н- и L-цепей каждого человече­ского гена иммуноглобулина. Чтобы решить эту задачу, мышиные гены Н- и κ-цепей были заменены («нокаутированы») небольшим участком кластера генов Н-цепи че­ловека и кластера ге­нов κ-цепи человека. Трансгенные мыши с таким набором генов антител человека синтезировали человеческие антитела к некоторым антигенам; кроме того, были созданы гибридомы, продуци­рующие человеческие моноклональные антите­ла.

Однако разнообразие человеческих антител, продуцируемых такими трансгенными мышами, было невелико вследствие ограниченности на­бора вариабельных сегментов Н- и κ-цепей. Чтобы решить эту проблему, создали YАС с большим числом генов вариабельных участков Н- и κ-цепей гемоглобина человека. Объединив четыре разные YАС с генами Н-це­пей гемоглобина человека, создали YАС длиной 1000 т. Н., несущую 66 V H-доменов, около 30 D H-сегментов, 6 J H-доменов, Сμ, Сδ и Сγ. Анало­гично, из трех YАС, несущих различные домены Vκ, создали YАС длиной 800 т. С 32 Vκ-доме­нами, 5 Jκ-доменами и Сκ.

ЕS-клетки трансфицировали по отдельности YАС с генами Н- и κ-цепей методом слияния клеток, отобрали клетки, в которых произошла интеграция YАС, с помо­щью селективного маркера и проверили целост­ность каждой вставки методом ПЦР. Инъециро­вали клетки, несущие встроенные гены Н- либо κ-цепи, в бластоцисты и идентифицировали особь-основателя с помощью ПЦР. Трансгенных мышей со вставками генов Н- и κ-цепей скрещи­вали по отдельности с мышами с инактивированными локусами этих цепей.

Затем потомство скрещивали между собой, чтобы получить мы­шей, лишенных функциональных мышиных ге­нов Н- и κ-цепей, но несущих обе вставки генов Н- и κ-цепей гемоглобина человека. Трансгенные мыши с увеличенным числом человеческих V H- и Vκ-доменов синтезировали человеческие антитела. Их иммунизировали тремя разными антигенами, и в каждом случае гибридомы секретировали человеческие моноклональные антитела, обладающие высоким сродством к антигену, которым животные были иммунизированы. Весьма вероятно, что с помо­щью такой трансгенной системы удастся полу­чать человеческие моноклональные антитела для использования их в медицине. Трансгенные мыши: применение Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза продуктов, представляющих интерес для медицины.

Используя целых животных, можно моделировать и возникновение патологии, и ее развитие. Однако мышь — не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэто­му данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее в некоторых случаях они позволяют вы­явить ключевые моменты этиологии сложной бо­лезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генети­ческих болезней человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образова­ние опухолей, гипертония, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной сис­темы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие.

Трансгенный крупный рогатый скот Если предполагается использовать молочную железу в качестве «биореактора», то наиболее предпочтительным животным для трансгеноза является крупный рогатый скот, который еже­годно дает до 10 000 л молока, содержащего примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. По случайному совпадению, именно столько белка С, использующегося для предотвраще­ния тромбообразования, требуется ежегодно.

С другой стороны, одной трансгенной коровы будет более чем достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови, который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови. Для создания трансгенных коров исполь­зовали модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК (рис. Процедура включала следующие основные этапы.

Сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне. Созревание ооцитов in vitro. Оплодотворение бычьей спермой in vitro. Центрифугирование оплодотворенных яйце­клеток для концентрирования желтка, кото­рый в нормальных яйцеклетках мешает визу­ализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа. Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус. Развитие эмбрионов in vitro. Нехирургическая имплантация одного эмб­риона реципиентной самке во время течки.

Программы, игры, книги, фильмы. Скачать бесплатно Торрент Сваты 4 6 Серия Без Регистрации, смотреть онлайн Торрент Сваты 4 6 Серия Без Регистрации - поиск файлов. Конструктор договоров профессионал кряк.

Скрининг ДНК потомков на наличие трансгена. В тестовых экспериментах из пула в 2470 ооцитов были получены два трансгенных телен­ка.

Этот результат указывает на результатив­ность описанного подхода, но также и на его низкую эффективность. Исследования в этой области продолжаются, и есть надежда на усо­вершенствование методики трансгеноза. На­пример, скоро появится возможность отбирать небольшое число клеток у развивающегося эмб­риона in vitro и тестировать их на наличие трансгена; такая потеря клеток эмбрионом не помешает его нормальному развитию. Этот тест позволит имплантировать только эмбрионы, не­сущие трансген.

Одна из целей трансгеноза крупного рогато­го скота — изменение содержания в молоке раз­личных компонентов. Так, количество сыра, по­лучаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем κ-казеина, поэтому весьма перспективным представляется увеличение ко­личества синтезируемого κ-казеина с помощью гиперэкспрессии трансгена этого белка. Далее, если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы, то можно будет полу­чать молоко, не содержащее лактозы.

Такое мо­локо незаменимо для многих людей, не переносящих лактозу; после приема молока или молоч­ных продуктов у них возникает серьезное желу­дочное расстройство. Трансгеноз крупного рога­того скота — это весьма перспективный подход, но создание большого числа трансгенных живот­ных потребует времени, ведь для того чтобы вы­растить половозрелое животное из оплодотво­ренной яйцеклетки, нужно примерно 2 года. Весьма актуально создание домашних живот­ных с наследственной устойчивостью к бактери­альным и вирусным инфекциям и паразитар­ным инвазиям.

Трансгенные Животные И Растения Презентация

Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бакте­риальным инфекционным заболеваниям - мас­титу (коровы), дизентерии (новорожденные по­росята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать не­сущих его трансгенных животных.

В настоящее время для борьбы с инфекционными заболева­ниями домашних животных используют при­вивки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тща­тельное наблюдение. Стоимость всех этих меро­приятий может достигать 20% обшей стоимости конечной продукции. Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании пу­тем трансгеноза наследуемых иммунологиче­ских механизмов. С этой точки зрения рассмат­ривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадежи­вающими на настоящее время являются предва­рительные результаты, полученные при введе­нии мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи какого-либо моноклонального антитела. Идея этого подхода за­ключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с по­мощью прививок.

Введение в организм реципиента генов ан­тител, которые связываются со специфиче­скими антигенами, было названо иммуниза­цией in vivo. Для этого гены Н- и L-цепей иммуноглобулинов моноклонального мышиного антитела к антителу, связывающемуся с 4-гидрокси-3-нитрофенилацетатом, вводили с помощью микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи.

Во всех случаях в сыворотке трансгенных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонального антитела. Однако количест­во моноклональных антител, содержащих це­пи Н и L, было невелико.

Чтобы установить, можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгенные кон­струкции. Получение трансгенных коров. Трансгенные овцы, козы и свиньи Опыты по трансгенозу в случае овец и коз в ос­новном были направлены на превращение мо­лочных желез этих животных в своеобразные биореакторы для получения белковых продук­тов, использующихся в медицине. Несмотря на то что надои у овец и коз меньше, чем у коров, за год они дают сотни литров молока. С помощью метода, аналогичного используемому для создания трансгенных мышей и трансгенных конструкций, содержащих гены человека под контро­лем промоторов, специфичных для молочных желез, были созданы трансгенные овца и коза, в молоко которых секретировались белки человека.

Они были гликозилированы и обладали активностью, близкой к таковой соот­ветствующих белков, получаемых от человека. Однако, для того чтобы убедиться в полной эквивалентности этих белков, нужны дополни­тельные исследования. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказыва­ла никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потом­ство.

В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычего гормона роста под контролем промотора металлотионеина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа бы­стрее прибавляла в весе. К сожалению, этот по­ложительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмеча­лись язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неиз­вестны. Возможно, они связаны с долговремен­ным присутствием в организме избытка гормона роста.

В этих экспериментах трансген синтези­ровался более или менее непрерывно. Были соз­даны также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста I была помещена под контроль мышиного промо­тора гена кератина с высоким содержанием се­ры, что обеспечивало гиперэкспрессию кДНК. При этом у трансгенных овец в отличие от сви­ней никаких нежелательных побочных эффек­тов не наблюдалось.

Положительные результаты были получены и в ходе экспериментов с трансгенными свинья­ми. Например, были созданы здоровые транс­генные свиньи, в геноме которых присутствова­ла следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена β-глобина человека, два гена α 1-глобина человека и один ген β А-глобина человека. В результате ее экспрессии в клетках крови свиней синтезировался человеческий гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена β-глобина сви­ным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве.

Человече­ский гемоглобин, продуцируемый трансгенны­ми свиньями, обладал такими же химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией. Эти результаты указывают на принципиаль­ную возможность замены цельной крови, ис­пользуемой при трансфузии, человеческим ге­моглобином, полученным методом трансгеноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро раз­рушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны для почек.

Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгеноза - это дело далекого будущего. В последнее время большое внимание уделя­ется вопросу об использовании органов живот­ных для трансплантации человеку.

Основная проблема межвидовой трансплантации — это ги­перострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного орга­на. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих антитела клеток и быстрая потеря переса­женного органа.

В естественных условиях воспалительная ре­акция блокируется особыми белками на поверх­ности клеток, выстилающих стенки кровенос­ных сосудов. Эти белки — ингибиторы комплемента видоспецифичны.

Было высказа­но предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующего комплемент, то переса­женный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенные свиньи, несущие различ­ные человеческие гены ингибитора комплемен­та.

Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента. Предварительные эксперименты по пересадке органов транс­генных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются слабее, а сам орган не отторгается немного дольше.

Воз­можно, трансгенные свиньи, несущие человече­ский ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает острейшее отторжение, будут служить источником органов для транспланта­ции человеку. Трансгенные птицы Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйце­клетки птиц с целью получения трансгенных линий — непростая процедура. Это связано с не­которыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бы­вает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подхо­дит, поскольку в этом случае ДНК не интегри­руется в геном оплодотворенной яйцеклетки.

Наконец, даже если удастся осуществить микро­инъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яй­цеклетка после оплодотворения достаточно бы­стро обволакивается прочной мембраной, по­крывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками. Однако трансген можно вводить в область желтка (зародышевый диск), который содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образует­ся раньше, чем скорлупа.

После введения ДНК каждую яйцеклетку культивируют in vitro, и ко­гда образуется зародыш, его помещают в сурро­гатное яйцо, чтобы имитировать вылупление. При помощи такой стратегии была получена од­на линия трансгенных цыплят.

Однако в насто­ящее время этот метод неэффективен и техниче­ски трудновыполним в обычных условиях. К тому времени, когда наружная известковая оболочка яйцеклетки птиц затвердевает, заро­дыш, находящийся на стадии бластодермы, со­стоит из двух слоев по 40 000 и 80 000 клеток. Проведены эксперименты по инокуляции такого зародыша ретровирусными векторами с нару­шенной репликацией, несущими бактериальные маркерные гены. В результате были получены трансгенные цыплята и обыкновенные перепела, несущие чужеродные гены в клетках зародыше­вой линии. Обычно такие птицы не продуцируют свободных вирусных частиц, и тем не менее при­менение ретровирусных векторов в качестве «по­ставщиков» чужеродных генов животным, кото­рые затем могут использоваться в пищу, неизбежно вызывает вопросы относительно без­опасности такого подхода. Кроме того, размер трансгена, который может быть введен в орга­низм реципиента в составе ретровирусного век­тора, не превышает 8 т. Н., а в некоторых слу­чаях интеграция в исходный сайт нестабильна.

Все это заставило исследователей искать альтер­нативные способы трансгеноза. Никаких специфичных для птиц ЕS-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с исполь­зованием рекомбинантных эмбриональных кле­ток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липо-сом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародышевую область свежеотложенных яиц (рис. Часть потомков будет нести в каком-то неболь­шом количестве клетки донора: таких животных называют химерами.

У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных жи­вотных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках за­родышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрио­нов реципиента перед введением в них трансфи­цированных клеток (540-660 рад в течение 1 ч).

Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клет­ками реципиента увеличится в пользу первых. Discover english 3 скачать аудио. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффектив­ностью.